Нормотермическая EX VIVO перфузия изолированных легких в эксперименте с использованием отечественного перфузионного аппаратного комплекса

С.В. Готье (1,2), О.М. Цирульникова (1,2), И.В. Пашков (1), Д.О. Олешкевич (1), И.А. Филатов (5), В.К. Богданов (5), Д.М. Бондаренко (1), Н.П.Можейко, (1) А.А. Карпов (3) , Н.С. Буненков (3,4), Н.В. Грудинин (1)

1. ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика                В.И. Шумакова» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

2. ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университетимени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва,Российская Федерация

3. ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Российская Федерация

4. ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени И.П. Павлова» Минздрава России, Санкт-Петербург, Российская Федерация

5. ООО «БИОСОФТ-М», Москва, Российская Федерация

Заболевания респираторной системы являются социально значимой проблемой во всем мире, так как в своем исходе приводят к терминальной дыхательной недостаточности.

Трансплантация легких на сегодняшний день является наиболее эффективным радикальным способом лечения больных с тяжелой дыхательной недостаточностью. Однако применение трансплантации легких ограничивается крайне низким процентом донорских органов, пригодных для трансплантации.

Донорские легкие чрезвычайно восприимчивы к осложнениям смерти мозга, что сопровождается большой частотой развития неспецифических изменений, таких как нейрогенный отек, который делает легкие непригодными для трансплантации и как следствие приводит к отказу от изъятия донорского органа .

Совокупность факторов, влияющих на качество легочного трансплантата, обуславливает уменьшение количества пригодных легких донора до 15–20%, в то время как трансплантаты печени и почки в среднем используются в 69 и 90% случаев соответственно. Дефицит эффективных доноров легких приводит к летальности в листе ожидания до 20–40% за 1–2 года.

Одним из путей решения проблемы дефицита донорских органов является использование доноров с расширенными критериями и применение EX VIVO перфузии трансплантата с целью восстановления функциональной активности (реабилитации) донорского органа.

Относительно недавнее начало применения вышеуказанного метода в мировой практике, а также ограниченное количество исследований делают актуальным и необходимым развитие данного направления в отечественных программах с целью повышения эффективности трансплантационной помощи, что обуславливает потребность в проведении экспериментальных работ по разработке и усовершенствованию методики EVLP.

Целью представленного исследования являлось выполнение и оценка эффективности пилотной процедуры EX VIVO перфузии изолированных легких по замкнутому контуру с использованием собственного аппаратного перфузионного комплекса в условиях эксперимента.

В экспериментальном исследовании использованы изолированные легкие, полученные от барна массой 45 кг.

Эксперимент включал стадии наркотизации экспериментального животного, эксплантации легких,статической гипотермической консервации, инициации ex vivo перфузии легких с фиксацией основныхпараметров.

Хирургический доступ выполняли через срединную стернотомию. Перикард вскрывали продольно,тупым способом разделялась аорта и легочная артерия. После введения гепарина натрия в дозировке 300 ЕД/кг накладывали кисетные швы на аорту и легочную артерию. Аорта канюлировалась катетером 7 Fr для сбора донорской крови. Легочная артерия канюлировалась прямой канюлей 20 Fr. Первым этапом осуществляли заготовку аутокрови животного вгемоконтейнер с цитратным консервантом. По завершении заготовки крови в легочную артерию вводился раствор простагландина Е1 (алпростадил) 20 мкг.

С целью декомпрессии левых отделов сердца надсекалось ушко левого предсердия продольным разрезом. Далее через легочную артерию вводился раствор Сelsior™ (Ganzyme, Франция) при t 4 °С в объеме 2 литра. По окончании перфузии консервирующего раствора приступали к эксплантации легких. Для удобства изъятия легкие забирались вместе с сердцем единым комплексом, на трахею в 5–6 см от бифуркации накладывали аппаратный шов. По завершении эксплантации легкие помещались в стерильный пакет с последующей статической гипотермической консервацией в термоконтейнере в течение 2 часов.

В эксперименте перфузионный контур имел замкнутую структуру. В состав контура входили: кардиотомный резервуар, мембранный оксигенатор. К оксигенатору подключался гидроциркуляторный теплообменный элемент, деоксигенирующая смесь  в составе: N2 – 86%, CO2 – 8%, O2 – 6%, кислородно-воздушная смесь. В системе магистралей между кардиотомным резервуаром и оксигенатором устанавливался центробежный насос искусственного кровообращения «ООО БМОСОФТ-М» c гидрофильной головкой. Магистраль после оксигенатора соединялась с канюлей, установленной в легочной артерии. Отток в оксигенатор осуществлялся активным способом через канюлю, установленную в левом предсердии. Измерение давления в системе магистралей проводилось путем установки трех инвазивных датчиков: первый устанавливался после оксигенатора для измерения давления в проксимальном отделе перфузионного контура, второй – непосредственно в канюле легочной артерии для измерения перфузионного давления в легочной артерии, третий датчик измерял давление в канюле, установленной в левом предсердии. Трансплантат позиционировали в стерильном контейнере, сообщающимся с кардиотомным резервуаром. Перфузия трансплантата осуществлялась через легочную артерию, дренаж перфузата происходил активно через канюлю, установленную через стенку левого желудочка в левое  предсердие (устройство контура схематично изображено на рис. 1.)

В качестве перфузата использовали собственный перфузионный раствор на основе альбумина человека. Объем перфузата составлял 1,5 литра. Эритроцитарная масса заготавливалась путем центрифугирования цельной делейкоцитурированной крови в течение 15 минут со скоростью 3500 оборотов в минуту. К перфузату добавляли: меропенем – 1000 мг,метилпреднизолон – 1000 мг, инсулин короткого действия – 4 ЕД, раствор глюкозы 40% – 5 мл. Целевой уровень гематокрита составлял 15%. Протокол эксперимента был разработан на основе протокола EX VIVO перфузии донорских легких, предложенного M. Cypel et al. (Торонто, Канада) в 2009 году [20]. Продолжительность процедуры EX VIVO перфузии составила 360 минут.

Исходная температура перфузата составляла20 °С, целевое давление в легочной артерии не должно превышать 15 мм рт. ст. Скорость перфузии регулировалась исходя из значений давления в легочной артерии и левом предсердии в начале перфузии и составляла 150–200 мл/мин. Давление в левом предсердии регулировалось высотой позиционирования кардиотомного резервуара, оптимальный диапазон составлял 3–5 мм рт. ст. Поток газо-воздушной смеси, где FiO2 <0,5, устанавливался, соответствуя целевым минимальным значениям pO2 >100 мм рт. ст. Для достижения pCO2 на уровне 40–50 мм рт. ст. требовалось использование деоксигенирующей смеси со скоростью потока, составляющей 1 : 1 к скорости перфузии. Контроль ионного и газового состава перфузионного раствора проводился на газоанализаторе ABL 800. Целевой объем перфузии составлял 40% от расчетного сердечного выброса. При стабилизации всех параметров в течение 20 минут проводилось увеличение скорости перфузии до 800 мл/мин, согревание перфузата до 32 °С.

По достижению целевой температуры в 34 °С инициировалась искусственная вентиляция легких. Параметры вентиляции складывались из объема на вдохе 7 мл/кг, ПДКВ – 5 см вод. ст., ЧД – 10/мин. Фракция кислорода на вдохе составляла FiO2 <0,5. Проводился контроль газового состава перфузата. В течение последующих 20 минут достигали целевой температуры 37 °С, объемная скорость перфузии увеличивалась до 40% от сердечного выброса (из расчета 70 мл/кг массы экспериментального животного) и составляла 1200 мл/мин. Продолжительность перфузии составила 360 минут. Общий вид легочного трансплантата в момент перфузии представлен на рис. 2.

После согревания трансплантата до 37 °C и стабилизации параметров газового и ионного состава перфузата при фракции кислорода на вдохе 50%  проводилась инструментальная, мануальная и лабораторная оценкаПальпаторно и визуально хирургом оценивались однородность паренхимы легких и отсутствие в ней инфильтративных изменений, осуществлялось расправление ателектазов. На протяжении всего периода перфузии путем прямого измерения оценивалось давление в легочной артерии и левом предсердии. Данные отображались на мониторе в режиме реального времени и фиксировались каждые 30 минут. Основными параметрами являлись: давление в легочной артерии (PAP, мм рт. ст.) и легочное сосудистое сопротивление (PVR,Wood/м2).

С целью анализа оксигенирующей функции легких отбирали две порции крови из венозной легочная артерия) и артериальной канюли (левое предсердие). Анализ образцов проводили на газоанализаторе крови ABL 800 (Radiometer Medical ApS,Дания). Использовали уравнение PaO2/FiO2 (отношение парциального напряжения кислорода в крови к фракции кислорода на вдохе) для расчета индекса оксигенации. Полученные данные были перенесены на график в зависимости от временных точек,соответствующих периодам оценки трансплантата.

По завершении перфузии фрагменты паренхимы легких фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формальдегида (рН 7,4) не менее 24 часов. Для закрепления материала в парафиновые блоки использовалиизопропиловый спирт и петролейный эфир. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопический анализ проводили на световом микроскопе при окуляре 10, объективах 4, 10, 40 и 100. Фотосъемку проводили с помощью цифровой фотокамеры.

Полученные срезы оценивал врач-патологоанатом на предмет тромбоза сосудов, кровоизлияний,явлений развития интерстициального, альвеолярного отека, а также клеточной инфильтрации.

Соотношение PaO2/FiO2 до момента эксплантации донорских легких составляло 240 мм рт. ст. На протяжении всей процедуры ex vivo перфузии прослеживалась положительная динамика роста респираторного индекса. Спустя 360 минут перфузии индекс оксигенации составил 430 мм рт. ст., что является хорошим показателем восстановления респираторной функции легких (рис. 3).

В течение всей процедуры ex vivo перфузии отмечалось стабильное снижение легочного сосудистого сопротивления (ЛСС). В начале ЛСС составляло 800 дин·с/см5, однако под конец перфузии показатель ЛСС составил 320 дин·с/см5, динамика изменения легочного сосудистого сопротивления представлена на рис. 4.

Динамика изменений показателей динамического комплаенса от 20 до 46 мл/см вод. ст. на конец перфузии свидетельствует о ее адекватности и является косвенным критерием отсутствия отека легочной паренхимы. Именно данный показатель объективно представляет потенциал рекрутабельности легких и отражает воздушность и растяжимость легочной паренхимы. Данные изменения показателей динамического комплаенса легочного трансплантата не являются однозначным критерием пригодности донорского органа, однако свидетельствуют о сохранности легочной паренхимы (рис. 5).

Гистологическое исследование образцов легки после перфузии показало структурную целостность ткани и отсутствие признаков отека. В большинстве срезов альвеолы были хорошо раздуты. Альвеолярные воздушные пространства, а также перибронхоаскулярная соединительная ткань незначительно утолщены (рис. 6).

Фрагменты легкого имели сохранное строение.Паренхима легких патологически не изменена во всех группах образцов; в большинстве срезов отмечались хорошо раздутые альвеолы. Микроателектазы были распределены неоднородно в обеих группах и встречались только на отдельных участках. Альвеолярные воздушные пространства, а также перибронховаскулярная соединительная ткань незначительно утолщены.

Патофизиологические процессы, являющиеся следствием смерти головного мозга, приводят к интракорпоральному повреждению органов, в результате чего объективная оценка истинного функционального состояния донорских легких в значительной мере затруднена. Некоторые причины отказа от изъятия донорского органа (отек легких, низкие показатели газообмена, наличие большого количества гнойного бронхиального секрета и др.) могут быть скорректированы и оценены повторно при использовании методов экстракорпоральной перфузии легких.

С целью восстановления и оценки скомпрометированных легких, полученных от субоптимальных доноров, в клинической практике ведущих мировых трансплантационных центров используется методика экстракорпоральной нормотермической перфузии легочных трансплантатов (англ. ex-vivo lung perfusion – EVLP) . Данная методика позволяет минимизировать последствия воздействия на трансплантат повреждающих патофизиологических факторов донора, провести реабилитацию и повторную оценку трансплантата легких.

Появление процедуры нормотермической перфузии донорских легких EX VIVO открыло новые горизонты в развитии трансплантации легких во всем мире.

В 2006 году исследовательская команда Stig Stee et al. (Lund University Hospital, Sweden) доложила первые результаты успешной трансплантации одного легкого после процедуры EVLP [23]. В 2009 году Cypel et al. (Toronto, Canada) представили собственный протокол, впоследствии ставший наиболее распространенным за счет лучших результатов и в связи с возможностью проведения длительной перфузии,более 12 часов . Процедура EVLP позволила в несколько раз расширить пул донорских легких, тем самым увеличив количество трансплантаций. В проведенном исследовании за основу был взят протокол перфузии, разработанный Cypel et al. для оценки и реабилитации легких. В исследовании удалось продемонстрировать эффективность процедуры EVLP на первом компактном отечественном аппарате вспомогательного кровообращения в эксперименте на модели барана. Условия эксперимента были максимально приближены к клинической практике. На сегодняшний день в Российской Федерации не зарегистрировано ни одного устройства для нормотермической перфузии органов. Разработка отечественного перфузионного оборудования является приоритетным направлением в условиях дефицита донорских легких. Устройство вспомогательного кровообращения "Ex Stream", разработанное компанией ООО «БИОСОФТ-М», отличается малыми габаритами, высоким функционалом и простотой эксплуатации по сравнению с зарубежными образцами. Выбранный нами протокол перфузии по замкнутому типу является оптимальным и перспективным, позволяющий длительно перфузировать донорские легкие. Возможность длительной перфузии дает больше шансов на восстановление функции донорских легких, полученных от донора с расширенными критериями. Согласно протоколу Торонто, время, необходимое для адекватной оценки восстановления функции трансплантата легких, составляет от 4 до 12 часов [6, 22]. В эксперименте удалось добиться удовлетворительных показателей индекса оксигенации, составившего 430 мм рт. ст. на окончание перфузии, а также динамики снижения легочного сосудистого сопротивления, что свидетельствует об адекватной перфузии. Отсутствие явлений отека легочной паренхимы, патологических изменений по результатам гистологического исследования говорит об эффективности и безопасности методики [19, 20].

Экспериментальное исследование показало возможность проведения процедуры нормотермической EX VIVO перфузии с использованием устройства, разработанного для вспомогательного кровообращения и адаптированного для целей нормотермической EX VIVO перфузии. Представленный протокол продемонстрировал свою эффективность и перспективы дальнейшего использования и совершенствования.